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western蛋白提取步驟
蛋白提取方法
一、對于培養細胞樣品：
1. 融解Western及IP細胞裂解液，混勻。取適當量的裂解液，在使用前數分鐘內加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM。
2. 對于貼壁細胞：去除培養液，用PBS、生理鹽水或無血清培養液洗一遍(如果血清中的蛋白沒有干擾，可以不洗)。按照6孔板每孔加入100-200微升（6cm培養皿200-300ul）裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數下，使裂解液和細胞充分接觸。通常裂解液接觸細胞1-2 秒后，細胞就會被裂解。
對于懸浮細胞：離心收集細胞，用手指把細胞用力彈散。按照6孔板每孔細胞加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指輕彈以充分裂解細胞。充分裂解后應沒有明顯的細胞沉淀。如果細胞量較多，必需分裝成50-100萬細胞/管，然后再裂解。大團的細胞較難裂解充分，而少量的細胞由于裂解液容易和細胞充分接觸，相對比較容易裂解充分。
3. 在冰上充分裂解20-30min后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進行后續的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
裂解液用量說明：通常6孔板每孔細胞加入100微升裂解液已經足夠，但如果細胞密度非常高可以適當加大裂解液的用量到150微升或200微升。
二、對于組織樣品：
1. 把組織剪切成細小的碎片。
2. 融解Western及IP細胞裂解液，混勻。取適當量的裂解液，在使用前數分鐘內加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM。
3. 按照每20毫克組織加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以適當添加更多的裂解液，如果需要高 濃度的蛋白樣品，可以適當減少裂解液的用量。)
4. 用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。
5. 充分裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進行后續的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
6. 如果組織樣品本身非常細小，可以適當剪切后直接加入裂解液裂解，通過強烈vortex使樣品裂解充分。然后同樣離心取上
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