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牙鲆腦中促性腺激素釋放激素受體的克隆和鑒定
GnRH(gonadotropin-releasing hormone)是下丘腦-垂體-性腺軸中重要的十肽信息分子,在所有的脊椎動物的生殖神經內分泌調控中具有重要的作用.GnRH成熟的十肽沿著軸突被運送到下丘腦正中隆起(median eminence)末端,然后進入下丘腦垂體門脈循環(hypothalamo hypophyseal portal circulation)(四足動物)或直接通過軸突末梢(大多數硬骨魚)把信號傳遞給刺激性腺的細胞,與特異性受體結合,刺激促性腺激素(GtHs,gonadotropins)的合成與釋放,參與脊椎動物繁殖的起始和維持正常生殖功能.伴隨著GnRH的研究,研究者對魚類GnRH受體的研究也越來越感興趣,牙鲆(Paralichthys olivaceus)是中國重要的海水養殖魚類,本研究從牙鲆腦組織中克隆得到全長的TypeⅠ GnRH受體,并對其組織特異性表達作了分析,為牙鲆的神經生殖內分泌研究奠定了一定的基礎.在本研究中,以海水養殖牙鲆為材料,從牙鲆腦組織中采用巢式PCR、5'-和3'-RACE技術克隆得到了1 671 bp牙鲆促性腺激素釋放激素受體(GnRH-R)全長cDNA序列,包括147 bp的5'-UTR、1 248 bp的開放閱讀框和276 bp的3'-UTR,GenBank登錄號是DQ011872.牙鲆GnRH-R和其他物種GnRH-R的氨基酸序列的多序列比對結果顯示,其存在許多保守的特征,牙鲆GnRH-R顯示有3個主要的功能區域:1個N端胞外結構域(1～44個氨基酸殘基)、1個大的跨膜結構域(45～324個氨基酸殘基)和1個C端細胞質區域(325～415個氨基酸殘基).空間結構預測顯示牙鲆GnRH-R跨膜區域包含7個高度保守的跨膜α螺旋(45-64、76-95、114-135、156-176、207-224、267-286、305-324),這些α螺旋是受體錨定到細胞膜上必需的.氨基酸序列系統進化分析表明,牙鲆GnRH-R與琥珀魚GnRH-R1具有高度同源性(85%同源性).已知的硬骨魚GnRH-R基因的系統進化分析表明,存在兩種類型的GnRH-R基因:Type Ⅰ GnRH-R和TpyeⅡGnRH-R基因.在牙鲆GnRH-R的氨基酸序列中,具有Type Ⅰ GnRH-R共有的典型基序:CAFVT(TM Ⅲ)和DLEGKVSHSLTH(TM Ⅶ開始的序列處),表明克隆得到的牙鲆GnRH-R屬于Type Ⅰ GnRH-R.GnRH-R跨膜α螺旋之間的區域形成了胞內或胞外loops,這些區域參與受體信號轉導和肽選擇性功能上.牙鲆GnRH-R在TMⅢ的細胞質邊界處具有一個保守的DRQSAI(DRⅩⅩⅪ/Ⅴ)基序,這個基序被認為參與G蛋白偶聯信號轉導和GnRH肽誘導受體的激活;另一個保守的區域是位于TMⅦ內的NPXXY或DPXXY基序同樣存在于牙鲆中(DPVIY),這個基序參與到一些GPCRs(包括GnRH-R)的內在化(internalization),同時這個基序特別是基序中的Tyr殘基對于受體激活和信號轉導起到關鍵作用.在第三個胞內loop中,魚類GnRH-R有個保守的Ala殘基(在牙鲆中為Ala258),其也在G蛋白偶聯和受體內在化方面具有重要作用.在哺乳動物或非哺乳動物GnRH-R中,在第一個和第二個胞外loop之間由2個Cys形成1個保守二硫橋,是受體的正確折疊必需的.和其他的GnRH-R一樣,牙鲆GnRH-R在第一個和第二個胞外loop之間存在由2個Cys(Cys112和Cys190)可以形成的潛在的二硫橋.這個二硫橋的完全缺失將會影響受體的結構完整性和降低魚類GnRH-R對GnRH肽的選擇性.GnRH-Rs的NH2-末端區域不是很保守,但含有糖基化位點,是GnRH-Rs表達、GnRH-Rs穿梭到細胞胞表面或受體穩定必需的.將mouse的GnRH-R糖基化位點引進到人GnRH-R中,可以增加受體的數量,但不影響受體結合力或肽選擇性[25-26].牙鲆Type Ⅰ GnRH-R中在NH2-末端含有3個潛在的糖基化位點(N11SSW、N15GSS和N22WTA),此外,在第一個胞外loop和第二個胞外loop中分別存在1個糖基化位點(N100ITV和N178VTI),牙鲆Type Ⅰ GnRH-R含有的糖基化位點比哺乳動物要多,牙鲆糖基化位點的數目是否/怎樣影響牙鲆GnRH-R的表達、降解率或親和力,應該進一步研究.在牙鲆GnRH-R的第一個胞內loop中,存在1個和tGnRH-RⅢ基序(80KRKSH84)一致的基序(69KRKSH74),這個基序是Gs識別基序(BBXXB,B代表堿性氨基酸,X代表任何一種氨基酸).已經證明這個基序和cAMP產生相關,cGnRH-Ⅱ能通過cAMP-PKA途徑提高stbGnRH-R在COS7細胞中的活性.和其他非哺乳動物GnRH-Rs相似,牙鲆GnRH-R含有1個C-末端細胞內尾巴.這種胞內尾巴是魚類GnRH-Rs功能必需的,在第三個胞內loop中,牙鲆GnRH-R含有2個PKC磷酸化位點(233SKR235和262TLK264);在C端尾巴中,存在1個PKC磷酸化位點(402TAR404).牙鲆GnRH-RC-末端尾巴中含有魚類GnRH-R具有的Src同源區3(SH3)結合區域(PxxP序列)(340PPAP),能夠潛在地傳送偶聯的能力到絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs),GnRH通過PKC和PKA調控GtHα和LHβ轉錄,二者都集中于MAPK水平.RT-PCR分析表明,GnRH-R在牙鲆腦和垂體有表達,暗示牙鲆GnRH-R參與到生殖行為如產卵行為;RT-PCR也檢測到牙鲆GnRH-R在卵巢和睪丸中有表達,其能與牙鲆cGnRH-Ⅱ和sbGnRH在卵巢中共表達,GnRH肽在卵巢中具有自分泌/旁分泌功能,對牙鲆卵巢中的GnRH受體可能起到調控作用.
作 者： 房保海 鄭法新 孫修勤 曲凌云 張進興 FANG Bao-hai ZHENG Fa-xin SUN Xiu-qin QU Ling-yun ZHANG Jin-xing 作者單位： 房保海,FANG Bao-hai(中國海洋大學,生命科學與技術學院,山東,青島,266003;國家海洋局第一海洋研究所,山東,青島,266061)鄭法新,ZHENG Fa-xin(中國海洋大學,生命科學與技術學院,山東,青島,266003)
孫修勤,曲凌云,張進興,SUN Xiu-qin,QU Ling-yun,ZHANG Jin-xing(國家海洋局第一海洋研究所,山東,青島,266061)
刊 名： 中國水產科學 ISTIC PKU 英文刊名： JOURNAL OF FISHERY SCIENCES OF CHINA 年，卷(期)： 2006 13(4) 分類號： Q959.486 關鍵詞： 牙鲆 促性腺激素釋放激素 促性腺激素釋放激素受體 Paralichthys olivaceus GnRH GnRH receptor【牙鲆腦中促性腺激素釋放激素受體的克隆和鑒定】相關文章：
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