新型重組人內毒素結合肽突變體的構建及原核表達純化

新型重組人內毒素結合肽突變體的構建及原核表達純化

目的 構建新型人內毒素結合肽(a new endotoxin binding peptide consisting of 25 amino acid residues,EBP_(25))及其突變體(mutant of EBP_(25),mEBP_(25))的原核表達重組質粒,并在大腸埃希菌中誘導表達.方法 采用PCR法,擴增EBP_(25)基因,構建pET-30-EBP_(25)融合表達載體并轉化E.coli DH5α擴增.重組質粒經酶切和測序鑒定后,應用快速定點突變法將EBP_(25)第2位纈氨酸和第5位谷氨酰胺所對應堿基均替換成賴氨酸所對應的堿基,突變后重組質粒再經測序鑒定后,將二者轉化至E.coli BL_(21)(DE_3)PlysS后經IPTG誘導表達,表達產物采用Western印跡進行鑒定后,用His-Tag親和層析對融合蛋白進行純化. 結果 兩次測序結果 顯示人EBP_(25)和mEBP_(25)重組序列和理論設計序列完全一致后,經IPTG誘導表達獲得目的融合蛋白,通過SDS-PAGE電泳、Western 印跡證實蛋白表達的特異性,并對蛋白進行純化,獲得EBP_(25)和mEBP_(25)融合蛋白. 結論 構建、表達純化了EBP_(25)和mEBP_(25)融合蛋白,為進一步研究其中和內毒素/脂多糖活性奠定了基礎.

作 者： 許成燕 劉友生 段光杰 朱江 徐小明 XU Chengyan LIU Yousheng DUAN Guangjie ZHU Jiang XU Xiaoming   作者單位： 第三軍醫大學西南醫院病理學研究所,重慶市,400038  刊 名： 醫學分子生物學雜志  ISTIC 英文刊名： JOURNAL OF MEDICAL MOLECULAR BIOLOGY  年，卷(期)： 2010 7(2)  分類號： Q78  關鍵詞： 內毒素結合肽   定點突變   原核表達   純化   endotoxin binding peptide   site-directed mutation   prokaryotic expression,protein purification  

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