插入甘氨酸對HIV Tat-胸苷激酶融合蛋白生物學活性的影響

插入甘氨酸對HIV Tat-胸苷激酶融合蛋白生物學活性的影響

目的:探討插入甘氨酸(Gly)對HIV Tat-TK融合蛋白功能的影響.方法:利用基因重疊(gene splicing by overlap extension, gene SOEing)PCR技術,將不同長度的甘氨酸密碼子(0、2、4、6個)插入HIV Tat-TK融合基因,經轉染、鑒定證實后誘導表達,并經偶聯Tat單克隆抗體的Sepharose CL-4B親和層析柱純化.4種HIV Tat-(Gly)n-TK系列融合蛋白(n=0、2、4、6)、HIV Tat蛋白、TK蛋白(1 μg/ml)分別與HepG2細胞在普通培養(yǎng)基共培養(yǎng)24 h后,間接免疫熒光檢測各自透過細胞膜效率;在加入更昔洛韋的培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后,錐蟲藍染色計算細胞死亡率,流式細胞儀檢測細胞凋亡率.結果:精確克隆出HIV Tat-(Gly)n-TK系列融合基因,成功表達HIV Tat-(Gly)n-TK系列融合蛋白以及HIV Tat和TK蛋白.HIV Tat-(Gly)n-TK系列融合蛋白與HIV Tat蛋白透過細胞膜的效率相似,但單獨TK蛋白無法進入細胞;在含有更昔洛韋的培養(yǎng)基中HIV Tat-(Gly)4-TK融合蛋白致HepG2細胞凋亡率最高(14.77%),其余依次為HIV Tat-(Gly)2-TK融合蛋白(12.69%)、HIV Tat-TK(8.31%)、HIV Tat-(Gly)6-TK(4.36%)和HIV Tat 組(1.03%),組間均有顯著性差異(P<0.05);細胞死亡率也發(fā)現類似的結果(分別為80.2%、65.4%、58.4%、56.7%、9.1%,組間有顯著差異,P<0.05).結論:插入2、4、6個甘氨酸對HIV Tat-TK融合蛋白上游Tat蛋白的細胞融合穿透功能不產生影響,而對融合蛋白下游TK蛋白介導的更昔洛韋的細胞毒作用干擾較大,其中插入4個甘氨酸對TK蛋白介導的更昔洛韋的細胞毒作用影響最小.

作 者： 闞全程 趙杰 余祖江 江河清 李曉菲 KAN Quan-cheng ZHAO Jie YU Zu-jiang JIANG He-qing LI Xiao-fei   作者單位： 闞全程,趙杰,李曉菲,KAN Quan-cheng,ZHAO Jie,LI Xiao-fei(鄭州大學第一附屬醫(yī)院藥劑科,鄭州,450052)

余祖江,江河清,YU Zu-jiang,JIANG He-qing(鄭州大學第一附屬醫(yī)院感染科,鄭州,450052) 

刊 名： 第二軍醫(yī)大學學報  ISTIC PKU 英文刊名： ACADEMIC JOURNAL OF SECOND MILITARY MEDICAL UNIVERSITY  年，卷(期)： 2006 27(3)  分類號： Q784  關鍵詞： 甘氨酸   胸苷激酶   Tat   重組融合蛋白質類   細胞內化作用  

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