真菌培養及鑒定

真菌培養及鑒定

、真菌培養及鑒定

1.采集標本 體表真菌的標本有毛發、皮屑、甲屑、痂等，標本在分離前常先用75%的乙醇消毒。深部真菌的標本可根據情況取痰、尿液、糞便、膿液、口腔或陰-道分泌物、血液、腦脊液、各種穿刺液和活檢組織，采集標本應注意無菌操作。

2.培養檢查：可提高真菌檢出率，并能確定菌種。標本接種于葡萄糖蛋白胨瓊脂培養基(Sabouraud agar)上，置室溫或37℃培養1～3周。必要時可行小培養協助鑒定。菌種鑒定常根據菌落的形態及顯微鏡下形態判斷。對某些真菌，有時尚需配合其他鑒別培養基、生化反應、分子生物學方法確定。

真菌培養的方法與直接鏡檢法相比較而言，更能對大部分真菌感染的灰指甲作出準確的鑒定，也是診斷灰指甲的一個很重要的手段。下面我們就從培養基的選擇、培養時間、菌種鑒定三方面來了解一下灰指甲的真菌培養法。

1.培養基的選擇

通常培養真菌會同時選用兩種培養基，如果單用一種培養基，則容易忽略其它種類的真菌診斷。常見的兩種培養基，一種為沙氏葡萄糖瓊脂培養基中加抗菌劑，常為氯霉素和放線菌酮;另一種是沙氏葡萄糖瓊脂培養基中僅加氯霉素，不加放線菌酮。

2.培養時間

各種真菌的生長速度不同，所以報告的時間也不同。一般皮膚癬菌生長較緩慢，在26℃-28℃的環境下需要培養2-4周才能發報告，但是，皮膚癬菌含蓋的菌種較多也需要區別對待;酵母菌生長較快，通常2-3就可以發報告，如果為陰性則需要觀察1周;霉菌生長也比較快，一般2-4天就可以發報告。

3.菌種鑒定

(1)絲狀真菌：包括皮膚癬菌和霉菌，根據菌落形成所需要的時間，在不同條件下生長的情況，菌落表面及背面的形態、色素，培養基中有無色素，培養物用乳酚棉藍染色后鏡檢找特征性標志結構。(2)酵母菌：分為形態學鑒定及生化試驗。形態學鑒定主要觀察有無假菌絲產生，如有則為念珠菌屬，如無則為念珠菌以外的酵母菌;生化試驗最為常用的是API系統，用此法鑒定準確，但價格較貴。

)絲狀真菌：主要是形態學的鑒定，如直接涂片觀察，小培養顯微鏡鑒定，誘導形態觀察(25℃與35℃下雙相型真菌的特征孢子及菌絲的產生和兩種菌落的形成及腦心浸液瓊脂培養基，KT培養基，KelleyAgar培養基轉相誘導，另外常用的還有皮膚癬菌VB1生長刺激，吳氏熒光檢查，毛發穿孔試驗及在特殊情況下進行的一些生化鑒定等。其中，小培養顯微鏡檢對于絲狀真菌的鑒定，特點是動態直觀，易于觀察，且節約材料。解放軍總醫院第一附屬醫院皮膚科馬天

(2)酵母菌鑒定：形態學鑒定主要是玉米吐溫誘導下特征菌絲及特征孢子的檢驗，血清芽管形成，而在形態學基礎上還必須進行生化鑒定：有標準鑒定，自動儀器鑒定，顯色鑒定，其中，自動儀器鑒定(如API20C，ID32C等)，顯色鑒定對于酵母樣真菌的鑒定，特點是快速簡便;標準鑒定是按傳統雙歧表流程鑒定(包括糖同化試驗，糖發酵試驗，CAFC酚氧化酶試驗，尿酶試驗，KNO3同化試驗，脂肪酸需求試驗)，是真菌鑒定的金標準，系統準確，缺點是程序繁瑣，耗時長，與臨床治療不太適應。此外，還有血清學玻片凝集試驗，動物致病性實驗，分子生物學鑒定：如核酸雜交，DNA探針雜交，PCR擴增序列分析，PCR-SSCP單鏈構象多態性分析，PCR-RFLP限制性片段長度多態性分析，PCR-RAPD隨機擴增多態性分析，PFCG脈沖電泳核型分析等。

對于酵母樣真菌首選CHROMagar念珠菌顯色培養基，而顯色培養基不能鑒定的酵母樣真菌可采用自動儀器YBC卡進行鑒定或API板;條件較差的實驗室可采用傳統標準鑒定法中鑒定值較高的試驗，如酚氧化酶鑒定新型隱球菌(+)，尿素區分毛孢子菌屬(+)，地絲菌屬(-)，念珠菌屬(-)(克柔念珠菌/溶脂念珠菌+)，球擬酵母屬(-)，隱球菌屬(+)，玉米-土溫培養基上產菌絲區分念珠菌屬(+)與球擬酵母屬(-)，隱球菌屬(-)與毛孢子菌屬(+)，地絲菌屬(+)。而同化試驗推薦平皿法，一個平皿內可觀察多種糖類的同化情況，且結果易于觀察，重復性好。對于絲狀真菌及雙相型真菌，可采用小培養法，快速簡便易于觀察。而對于雙相型真菌還須經過腦心浸液培養基轉相試驗后確證。而血清學及分子生物學則主要用于流行病學和一些難培養難鑒定真菌的檢驗，由于成本高或要求技術難度較高，故而不適合在常規工作中采

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